Фармакопея. Издание XIV. Том II. Формы лекарственных средств, Лекарственное растительное сырьё, Радиофармацевтические/Генотерапевтические/Биологические/Гомеопатические лекарственные препараты и методы их анализа

% агарозы 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0 Размер ДНК [kbp] 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2 [kbp] – 1000 пар оснований ДНК Нижний предел размеров ДНК определяется в основном диффузией полосы в геле. В гелях с низкой концентрацией агарозы фрагменты ДНК небольших размеров разделяются, но четкость разделения полос невысокая. Верхний предел размеров ДНК находится в прямой зависимости от напряженности электрического поля, при которой проводится электрофорез. Чем меньше напряженность поля, тем более эффективно можно разделить длинные молекулы ДНК с большей молекулярной массой. Разделение одноцепочечных ДНК В процессе разделения в 1% агарозном геле одноцепочечная ДНК в электрическом поле движется быстрее (примерно на 10 %), чем двухцепочечная ДНК того же размера. Однако, одноцепочечная ДНК окрашивается бромистым этидием заметно слабее, чем двухцепочечная (примерно в 4-5 раз). В связи с этим, для получения окраски полос одинаковой интенсивности, необходимо использовать примерно в 5 раз большее количество образца одноцепочечной ДНК. Для разделения цепей ДНК нужно непосредственно перед электрофорезом прогреть испытуемые образцы около 1 мин при температуре 100 o C или добавить к образцу раствор натрия гидроксида до получения концентрации 0,1 М раствора и выдержать около 5-10 мин при комнатной температуре или при температуре 37 o C. В качестве маркеров для одноцепочечных ДНК возможно использование фрагментов двухцепочечных ДНК с известными размерами, подвергнутых денатурации при высокой температуре, а также коммерческих одноцепочечных маркеров. 3068